研究前沿 | 质粒DNA片段大小分布—CGE-LIF

对于基因治疗产品，宿主细胞残留DNA(HCD)是一种可能存在于最终的产品中的工艺相关杂质，其残留问题受到了生物制药用户的广泛关注，存在制瘤性和感染性。现有研究表明，可能引发致病的功能基因至少在200 bp以上，因此残留DNA片段越大，风险等级越高。美国食品药品监督管理局(FDA)在《Chemistry,Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs) 》中明确指出非致瘤性HCD的片段要小于200 bp;国家药品评审中心(CDE)在2022年5月发布《基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则》，明确指出生产若使用了肿瘤细胞系(如 Hela 细胞)、致瘤细胞系，或携带有致瘤基因、病毒来源序列的细胞(如 HEK 293T 细胞)，HCD的片段要小于200 bp，从而减少致瘤性和感染性风险。因此基因治疗终产品中需要合适的方法检测HCD的片段大小分布情况。

目前我们实验室有PA800 Plus 毛细管电泳仪，配备有UV,PDA及LIF检测器，其中LIF检测器可以用来快速检测质粒DNA的片段大小分布。

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核酸分子中糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态;加反向电压时，在电泳过程中从负极向正极移动;带电荷的核酸通过凝胶向正极迁移，迁移速率受到核酸的分子大小、构象、凝胶浓度、电场等因素影响;核酸与染料结合后会在特定波长下激发荧光信号。

CGE-LIF方法就是基于质粒DNA片段这样的特性，在毛细管内充满含有荧光染料的凝胶，在毛细管的两端赋予电流，在相同的电泳条件下，让不同大小的质粒DNA片段逐一到达检测窗口，从而达到分离和检测的目的。再经LIF检测器记录指定波长下激发的荧光信号，最终根据面积归一化法得到各组分的百分比。

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CE

 

▉ 案例分析

DNA Ladder

DNA Ladder

 

样品结果分析

通过样品与DNA Ladder对比，可以快速确定样品HCD片段大小是否<200bp，从而判断该样品是否合格。

▉ 结论

根据DNA Ladder各峰迁移时间比对，RSD在2.0%以内，重复性好，各峰的分离度好，灵敏度高，可以快速检测质粒DNA的片段大小分布。

我们生物分析表征团队拥有多年经验，主导或参与过多种生物分析方法开发与验证，包括大分子蛋白类药物、单抗/多抗类药物、ADC类药物、核酸类药物等，检测项目包含糖基化、电荷异质性/分子大小等;参照GMP和ISO/IEC17025质量体系要求建立了独立生物分析实验室，配置有LC-Q-TOF、LC-MS/MS、GC-MS 、HPLC/UPLC、毛细管电泳仪、酶标仪、圆二色光谱仪等高精尖仪器设备，我们一站式生物制品研发分析与服务平台，符合国际质量标准，可为客户提供生物分析表征专业的综合解决方案。

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本文参考资料来源：SGS检测认证